别急！流式细胞术中的“疑点难点”，你遇到的都在这里了！

四、流式细胞术的应用

五、操作过程中的注意点

1、上机前处理

小心荧光淬灭

操作时必须严格按照孵育时间，如果抗体孵育时间过长，荧光是会逐渐淬灭的。那如果不得不推迟实验怎么办？可以把试管放在冰里面，这样会稍稍延长淬灭的时间。

注意染色顺序

在进行多荧光染色的时候，相同的细胞会因为染色顺序不同而导致荧光强度的差异。解决办法为：预实验。做一系列的不同染色顺序的样本，通过对染色前和染色后的各种样本进行比较分析，判断染色顺序对细胞造成的影响。

选好染色方案

染色方案不合理也可能会导致荧光染色信号太弱。解决的方案：预实验。在正式开始实验之前，通过预实验，设计出一个完美的染色方案。（考虑试剂种类，试剂质量，试剂用量，孵育时间，洗涤次数，染料浓度，染色时间及染色温度等其他因素。）

做好阴性对照及同型对照试验

细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。

同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。

选择合适的抗体

通用原则是：为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。

2、参数设定

数据的获取必须是在仪器性能的校准均合格的基础上进行。仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定会直接影响结果。

电压

电压的调节需根据阴性对照管来调节。

阈值

可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值；大多数样本都可以设定FSC/SSC；阈值以下的信号不存储；可以根据阴性对照管来调节。

目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号。

补偿

流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。荧光补偿则可以从探测器种除去匹配荧光以外的任何荧光信号。

补偿方式：任意两个通道之间都可以调节。

补偿的调节：根据单染对照管来调节。

流式细胞术是一门已经很普及的细胞检测分选技术，但很多人知其然不知其所以然。今天小编决定赠送给大家一本书——《流式细胞术——原理、操作及应用（第2版）》，让您的 流式细胞术研究纵享丝滑！

《流式细胞术：原理、操作及应用（第2版）》特色：

运用大量的实例和示意图具体而形象地阐述了流式细胞术的原理和应用。以其在免疫学上的应用为基础，扩展到基础医学和生物学应用的多个方面。

本书还重点介绍了流式分选的具体应用，阐述了不同条件下流式分选的策略选择和注意事项，以及各种干细胞包括肿瘤干细胞等的流式分选。

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《流式细胞术——原理、操作及应用（第2版）》

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概述部分介绍基本概念和几款常见的流式细胞仪；原理部分具体介绍流式细胞仪的液流系统、光路系统、检测分析系统和分选系统；流式图部分主要介绍了流式通道、流式直方图、流式散点图和流式等高线图；

操作部分介绍了样品制备、荧光素偶联抗体及标记、光电倍增管电压设定、对照设置、补偿调节、阈值设定、死细胞问题处理、分选模式选择、上样速度控制、分选设门原则、分选基本步骤等内容；

流式分析术的应用部分具体介绍了流式细胞术在免疫学方面的应用，并且扩展到基础医学和生物学方面的应用；

流式分选术的应用部分阐述了不同条件下流式分选的策略选择和注意事项，同时还介绍了各种干细胞包括肿瘤干细胞等的流式分选方法。

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